Banques de shRNA poolés MISSION LentiPlex : 80 000 shRNA regroupés dans seulement 10 tubes pour un criblage haut débit facile et rapide
Avec le développement des banques d'ARN interférents, un criblage à haut débit peut être envisagé sur la base d'une diminution de fonction. Ces banques permettent en effet l'extinction parallèle et donc l'analyse de la quasi-totalité des gènes présents dans un noyau cellulaire. Les banques standards comportent un type de shRNA par puits et impliquent donc la manipulation de centaines de plaques, ce qui limite leur utilisation à quelques plateformes.
Pour faciliter les criblages à haut débit, nous avons créé la banque "LentiPlex Pooled shRNA Library" qui se caractérise par la couverture de l'ensemble du génome murin ou humain et un format lentiviral prêt à l'emploi :
Les banques LentiPlex murine et humaine Sigma Aldrich contiennent chacune un mélange d'environ 80 000 shRNA répartis dans 10 tubes matrix seulement. La manipulation d'une banque LentiPlex pourra donc se faire avec une seule boite contenant 10 tubes de particules lentivirales au lieu de 800 plaques :
• avec un minimum de réactifs et de consommables
• avec un minimum de temps d'expérimentation
• sans système robotique onéreux
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Banque standard de shRNA |
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| Banque de shRNA poolés LentiPlex | |||||
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En tant que membre du consortium RNAi (TRC), Sigma peut vous apporter dans le domaine des shRNA en format lentiviral, l'expertise scientifique combinée de nombreux laboratoires académiques et pharmaceutiques de renom. Le Broad Institute (MIT et Harvard) est l'un des membres les plus actifs du TRC. De plus, Sigma est doté d'une plate-forme automatisée pour la production des vecteurs lentiviraux. Le format lentiviral permet de travailler sur un très large spectre de cellules : lignées, cellules primaires et cellules quiescentes.
L'identification des shRNA qui induisent l'effet phénotypique étudié au sein de la population polyclonale transduite par la banque (80 000 shRNA dans le cas de la banque LentiPlex) a longtemps été considérée comme une étape limitante en raison de sa complexité. Sigma Aldrich vous propose aujourd'hui une solution simple et rapide avec son service à façon de déconvolution par séquençage haut débit.
La banque poolée LentiPlex s'utilise en trois étapes :
1. Transduction des cellules
Les banques murine et humaine LentiPlex contiennent toute la collection TRC1 du consortium RNAi (soit une moyenne de 5 shRNA par gène) clonés dans le vecteur lentiviral pLKO.1.
Les cellules à étudier sont transduites par la banque de shRNA. Les lentivirus recombinants vont transporter la séquence exprimant les shRNA dans la cellule et permettre leur intégration dans le génome de la cellule hôte. Les shRNA seront ainsi produits de manière constitutive et il sera possible d'observer les conséquences à long terme d'une diminution de fonction. On utilise une multiplicité d'infection inférieure ou égale à 1 afin que chaque cellule reçoive 1 seul clone shRNA. Le site d'intégration du provirus pouvant également influencer l'expression du shRNA, plusieurs expériences d'infections indépendantes sont recommandées afin de limiter cette influence éventuelle.
Sigma Life Science peut également produire des banques poolées à façon (constituées à partir de votre liste de gènes).
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| Structure du provirus intégré : | ||
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2. Culture des cellules pendant un temps suffisant pour permettre la diminution de l'expression des gènes par les shRNA
Le criblage est basé sur l'observation d'un effet phénotypique. La viabilité cellulaire et la survie des cellules sont des tests simples et populaires car ils ont permis de mieux comprendre les mécanismes génétiques des cellules cancéreuses : identification de gènes essentiels aux cellules cancéreuses, de shRNA prévenant la dégénérescence cellulaire, ou de shRNA conférant une résistance à des molécules inhibitrices ou toxiques pour la cellule…
Dans la population de cellules transduites, chaque cellule exprime un seul type de shRNA. Si l'action d'un shRNA donné sur la cellule (extinction du gène cible de ce shRNA) :
• induit une diminution de la viabilité cellulaire : on observe alors une diminution du nombre de cellules portant ce shRNA et donc une diminution du nombre de shRNA.
• favorise la survie de la cellule : on observe alors une augmentation du nombre de cellules portant ce shRNA et donc un enrichissement en shRNA.
• ne modifie pas la viabilité cellulaire : on observe un maintien du nombre de shRNA.
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Cette identification peut se faire en suivant l'évolution des shRNA :
• au cours du temps
• dans des échantillons traités ou non par une drogue
• dans des cellules provenant de différents patients…
3. Déconvolution
Si l'on choisit la viabilité des cellules comme phénotype de criblage, la déconvolution peut se faire très facilement par séquençage haut débit. Sigma Aldrich vous propose aujourd'hui ce type de service à façon : Vous nous envoyez les cellules ou les tissus transduits ou l'ADN génomique extrait de vos échantillons. Nous procédons à l'extraction de l'ADN (si nécessaire), à l'amplification des shRNA par PCR en utilisant des amorces qui s'hydrident à des séquences du vecteur pLKO.1 encadrant les séquences shRNA clonées, et qui contiennent les éléments qui permettront le séquençage haut débit (adaptateur et code barre). Les séquences de shRNA identifiées sont ensuite reliées à leurs identifiants TRC et comptabilisées. Les résultats sont fournis sous un format Excel facile à analyser.
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Avantages de ce service :
• Analyse d'une très grande quantité de données sans clonage et sans hybridation;
• Comptage précis de la fréquence des shRNA : enrichissement, réduction ou maintien du nombre;
• Large échelle dynamique avec détection des shRNA peu ou très abondants
• Rapidité d'exécution des travaux (environ 8 à 12 semaines)
• Economique
Pour plus d'information, cliquez sur les liens suivants :
Banque poolée LentiPlex
Formulaire pour une étude de faisabilité et un devis pour la déconvolution
Publications citant les banques poolées LentiPlex
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Demande d'information |
