La technique « hot-start » en PCR et PCR quantitative : améliorez vos rendements en augmentant la spécificité et la sensibilité de votre réaction !
Les techniques de « hot start » en PCR ont pour principe l'inhibition de l’activité de la Taq lors de la préparation de la réaction. De cette façon, le niveau des amplifications non spécifiques est réduit et le rendement en produit de PCR spécifique augmenté. Les méthodes classiques pour réaliser une PCR « hot start » sont soit des modifications chimiques de la polymérase, soit l’inhibition de l’activité de l’enzyme par un anticorps dirigé contre le site actif.
Nouveau chez Sigma Aldrich : les dNTP Hot Start CleanAmp
Les dNTP CleanAmp sont une nouvelle alternative pour faire de la PCR en conditions « hot start ». Ces dNTP modifiés aident à contrôler l’amorçage non spécifique et la formation de dimères d'amorces en bloquant l'incorporation des nucléotides à basse température.Ces nucléosides triphosphates modifiés par un groupe thermolabile de protection à l'extrémité 3’ (voir figure ci-dessous) sont activés par les températures élevées lors de la PCR. La présence de la modification bloque l’incorporation de nucléotides jusqu'à ce que le groupe protecteur soit éliminé par activation thermique. Lorsque des protocoles standards sont utilisés, une étape de dénaturation de quelques minutes à 95 °C permet une amplification optimale. Pour les protocoles rapides, la dénaturation initiale n'est pas nécessaire. Dans la majorité des cas, il suffit de remplacer les dNTP classiques par des dNTP CleanAmp et de procéder selon son protocole habituel.
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Une alternative plus classique mais toujours efficace : La JumpStart Taq DNA polymérase
La JumpStart Taq DNA polymérase de Sigma-Aldrich est une enzyme « hot start » inactivée par anticorps. Contrairement aux polymérases inactivées par modification chimique, l’activation de la JumpStart Taq polymérase ne nécessite pas d’étape de pré-incubation longue avant la PCR, car l'activité polymérase est entièrement restaurée au cours du cycle de dénaturation (les anticorps sont très rapidement détruits par la chaleur).
De ce fait, ces enzymes « hot start » anticorps sont beaucoup plus sensibles que les enzymes « hot start » chimiques, car leur activité est pratiquement de 100% dès les premiers cycles de PCR. A l’inverse, les enzymes « hot start » chimiques ne seront actives à 100% qu’après 10 à 15 minutes d’incubation (voir figure ci-dessous). Cette caractéristique permet d’améliorer significativement les résultats de PCR ou de qPCR pour les amplicons rares.
| Les enzymes ont été incubées à 94°C dans le tampon de réaction fourni. Des aliquots ont été prélevés au cours du temps et ont été utilisés dans un test d'activité standard. |  |
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