Modulation de l'expression des gènes et modification du génome : Sigma Aldrich étend encore sa gamme avec les CRISPR-Cas9

Avec le séquençage du génome d'espèces de plus en plus nombreuses, la modulation de l'expression des gènes et la modification du génome (KO, insertion ou remplacement) sont des domaines qui prennent de plus en plus d'importance. Les approches utilisées sont diverses: banques de cDNA pour la surexpression, banques d'ARN interférents pour l'extinction (siRNA, shRNA), et édition de gènes utilisant des nucléases ciblées telle que les Zinc Finger Nucleases, pour le knock-out.

Sigma Aldrich a été pionnière dans le domaine de l'édition de gènes, avec la commercialisation des ZFN et le développement récent de vecteurs ZFN adaptés aux cellules primaires. Nous utilisons maintenant notre expertise dans le domaine de l'ingénierie moléculaire pour vous proposer une nouvelle gamme : les CRISPR-Cas9.

Le système CRISPR*/Cas9, décrit en 2012, confère à certaines bactéries une sorte « d'immunité acquise » en leur permettant de lutter contre les phages et plasmides exogènes. Des petits fragments d'ADN étrangers, appelés protospacers, sont incorporés dans le génome entre les séquences répétées et servent de mémoire aux bactéries :

  • Il y a d'abord coupure des segments d'ADN étranger et intégration de ces segments à des endroits bien précis dans le bagage génétique de la bactérie.

• La cellule va alors produire de manière constitutive des petit ARNs (CRISP RNA ou crRNA) correspondant à cet ADN exogène. La maturation de ces crARN dépend d'un ARN trans-activateur (tracrRNA) qui possède une séquence complémentaire à la répétition palyndromique.

• Ces petits ARN pourront alors guider l'endonucléase Cas (CRISPR-associated) vers les ADN étrangers. Ils peuvent se lier aux deux brins de l'ADN et l'enzyme Cas9 va ainsi induire une coupure double brin de manière séquence spécifique.		  

Ce système a été adapté aux cellules de mammifères et utilisé pour générer une technologie permettant d'induire une coupure spécifique dans un locus génomique ciblé. Une étape importante a été franchie avec la mise au point d'un ARN guide qui combine les fonctions des tracrRNA and crRNA.
La technologie est basée sur l'utilisation (Figure 1) :

 

• D'une cassette exprimant un ARN guide comprenant :
    - Le protospacer :
    il s'agit d'une séquence de 20 nucléotides codant pour le crRNA. Elle est obtenue par :

  o Synthèse d'une paire d'oligonucléotides complémentaires contenant les sites de restriction adéquats en 5' et 3'

o Hybridation de la paire d'oligonucléotides et clonage dans le vecteur d'expression

    - Le motif PAM (Protospacer adjacent motif) : il s'agit d'une extension de 2 pb en 3' (GG ou AG).
    La séquence PAM est une forme de tracrRNA (trans-activating crRNA)

• D'une cassette exprimant la version humanisée de l'enzyme Cas9. Après coupure de l'ADN double brin au niveau de la région cible (DSB), il y a alors activation des mécanismes de réparation de l'ADN au niveau du site coupé. Si la réparation aboutit à des insertions ou des délétions de nucléotides qui modifient le cadre de lecture, l'expression de la protéine correspondante peut être abolie.

  

Figure 1 :
schéma de la cassure double-brin ciblé par le système CRISPR/Cas		  


Avantages du système CRISPR/Cas9 :

• La technologie est plus simple, plus rapide et plus économique que les technologies existantes. Elle est donc adaptée aux approches de criblage de nombreuses cibles.
• Il est possible d'utiliser de multiples séquences d'ARN de guidage pour modifier simultanément plusieurs locus différents dans un même génome.

Limites du système :

• Elles portent sur l'occurrence du motif PAM (NGG) et les effets off-target possibles puisque la séquence assurant la spécificité de la reconnaissance n'est que de 14 à 15 paires de bases. Le système pourrait présenter plus d'effets off-target que les ZFN, c'est pourquoi nous recommandons d'utiliser les CRISPR en première approche de criblage et les ZFN pour valider les résultats sur un nombre restreint de cibles.

Caractéristiques du système Sigma Aldrich :

 

• Vecteurs prêt à l'emploi : nous désignons deux oligonucleotides de 31 et 27 mers contenant la séquence cible et nous procédons au clonage des oligonucléotides

  o Plasmides CRISPRs pré-désignés pour l'humain, le rat et la souris
o Plasmides CRISPRs à façon pour les autres espèces et pour les applications autres que le Knock-Out

• Vous pouvez procéder directement à la transfection de vos cellules cibles

  

Avantage du système Sigma Aldrich :

• La cassette exprimant l'ARN guide et la cassette exprimant la protéine Cas9 sont combinées dans un seul plasmide (Figure 2), vous n'avez donc qu'un seul plasmide à transfecter dans vos cellules.
• La séquence codant pour l'ARN guide est sous le contrôle du promoteur U6 qui assure une expression efficace de cet ARN. Le promoteur CMV contrôle l'expression de la nucléase Cas9 et de la GFP.
• La fusion de la GFP en C-terminal de la nucléase Cas9 par un peptide 2A, permet de visualiser la transfection et éventuellement de trier les cellules transfectées au FACS.
• L'Algorithme développé par Sigma Aldrich inclue les dernières règles de design afin de limiter au maximum les effets off-target.

Figure 2 :
schéma de la cassette d'expression U6:gRNA-CMV:Cas9-GFP
dans le système à plasmide unique

 

Références bibliographiques

Pour plus d'information, consultez cette page ou contacter Nadia Guettari.

* Les CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sont des familles de séquences répétées largement présentes chez les procaryotes, comprenant des séries de répétitions directes, courtes (de 21 à 37 paires de bases), régulièrement espacées par des séquences, généralement uniques, de 20 à 40 paires de bases.

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