Validation de l'extinction de gènes par la technique AQUA-Peptides :
une méthode simple, sensible et efficace pour quantifier votre protéine.
La vérification de l'extinction de gènes constitue une application nouvelle et puissante de la technique AQUA. En effet, la quantification de protéine par cette technique en spectrométrie de masse s'est révélée efficace pour mesurer l'expression de gènes éteints et vérifier la réalisation du knockdown, comme le démontre l'exemple ci-dessous :
 |
Figure 1: des cultures HeLa ont été transfectées avec des siRNA de GAPDH humaine (9.6 nM, 19 nM, et 38 nM), RISC free (non functionnelle, non interférente), 2 séquences non interférentes, et un pool non interférent. 4 transfections "blanches" ont été également réalisées. Les cellules transfectées ont été incubées pendant 48 heures. Les protéines ont été extraites, précipitées, mélangées quantitativement avec les AQUA peptides, digérées à la trypsine puis analysées en LC-MS phase inverse. Les chromatogrammes pour les mélanges natifs et ceux avec les AQUA peptides de la GAPDH ont été généréesR; les concentrations en GAPDH ont été calculées sur la base des comparaisons des aires de pics. |
La quantification par AQUA offre de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles utilisées pour mesurer l'expression de gènes éteints :
• La sensibilité AQUA n'est limitée qu'à la sensibilité du spectromètre de masse, permettant ainsi aux chercheurs d'étudier l'extinction de gènes codant pour des protéines faiblement abondantes, ou de détecter de très faibles expressions de gènes éteints. Cette caractéristique représente un avantage considérable en regard des méthodes traditionnelles comme le Western Blot ou l'ELISA.
• Un AQUA peptide peut être généré sur la base d'une simple séquence en acides aminés, même si aucun peptide natif n'a été isolé, ou si aucun anticorps spécifique n'existe. Pour cette raison, l'AQUA peptide peut être utilisé pour mesurer n'importe quel gène, même simplement prédit, alors que les méthodes alternatives comme le Western Blot ne le peuvent pas.
• La technique de quantification par AQUA permet de mesurer l'expression du peptide (et de la protéine correspondante), et fournit donc une corrélation plus précise à l'efficacité d'extinction, comparée avec les techniques de PCR quantitative ou de Northern Blot.
Développés en collaboration avec le Protein Quantitation Consortium, les AQUA Peptides Sigma-Aldrich permettent une quantification MS efficace et précise de biomarqueurs protéiques.
Dans une expérience AQUA, une quantité connue d'AQUA Peptide est ajoutée à un extrait protéique. L'échantillon est alors digéré à la trypsine puis analysé par HPLC-MS. Les chromatogrammes sont générés pour le peptide natif et l'AQUA peptide synthétique, standard interne. Les ratios des pics obtenus permettent de quantifier le peptide natif.
Pour plus d'information consultez cette page.
 |
Demande d'information |
