Zinc Finger Nucléases (ZFN):
une technologie qui donne enfin accès aux rats KO

En génie génétique, la technique permettant de désactiver un gène en remplaçant son allèle normal par un allèle mutant non fonctionnel se nomme Knock-Out (KO). Les animaux Knock-Out permettent de mieux comprendre l’expression et la fonction des gènes. Ils constituent aussi des modèles de pathologies humaines et peuvent conduire à la découverte de nouvelles cibles et molécules thérapeutiques.

Récemment des chercheurs du Medical College of Wisconsin et de la plate-forme « Transgenèse Rat » de l'INSERM U643 ont utilisé des Zinc Finger Nucléases (ZFN) pour créer les premiers rats avec un KO ciblé (Figure 1). Ils ont pu invalider un gène rapporteur et deux gènes natifs sans créer d’effet "off-target" mesurable (http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/325/5939/433). Cette technologie a été classée en 5ème position du Top 10 des innovations 2009 du magazine «The Scientist»:
(www.the-scientist.com/top10innovations).

Figure 1 : Principe de la technologie CompoZr « ZFN»
• Reconnaissance d’une séquence d’ADN spécifique de vingt-quatre nucléotides par des protéines en doigts de zinc : cette séquence n’a pratiquement aucune chance d'exister à plus d'un exemplaire dans le génome des eucaryotes.
• Clivage de l’ADN : les protéines sont couplées au domaine endonucléasique de FokI qui coupe l’ADN au niveau du site de reconnaissance.
• Modifications au niveau du site de coupure : Délétion, modification ou insertion génétiques lors de la réparation de l’ADN puis Insertion d’une séquence d’ADN par recombinaison homologue en présence d’un ADN donneur.

 
CompoZr, fruit d’un partenariat exclusif entre Sigma life Science et Sangamo BioSciences, permet un ciblage très précis des mutations. La fréquence de modification élevée facilite grandement le criblage et permet de s’abstenir de marqueurs de sélection.


Cette publication ouvre de nouvelles perspectives dans l’utilisation des animaux transgéniques. Elle montre que la technologie ZFN :

- Permet d’élargir le panel des espèces que l’on pourra utiliser comme modèle KO (voir les détails)

- Réduit considérablement le temps d’obtention des animaux KO : l’injection se fait directement dans l’embryon et le rendement élevé limite fortement les expériences de screening.

L’approche ZFN pour l’obtention de KO transgéniques a également été validée chez le poisson zèbre (Figure 2) et elle est actuellement testée chez de nombreuses espèces. Pour accompagner ce développement, Sigma Aldrich a décider de créer la plateforme SAGE (Sigma Advanced Genetic Engineering Labs) pour générer des animaux transgéniques en utilisant la technologie ZFN.

Figure 2 : Creation de KO ciblés avec la technologie CompoZr Les ZFNs (ARNm ou plasmides) sont transfectés dans les cellules ou micro-injectés dans les embryons. Après clivage de l’ADN double brin, les processus imparfaits de réparation de l’ADN conduiront à la création de mutations qui conduiront à l’extinction de l’expression du gène ciblé.


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