Transgénèse contrôlée dans les cellules humaines

   Le nouveau kit CompoZr permet d'intégrer rapidement un gène d'intérêt au niveau du site spécifique et unique (AAVS1) du chromosome 19 humain. Contrairement aux autres méthodes utilisées pour l’expession de transgènes dans les cellules humaines, ce kit offre la possibilité aux utilisateurs d’étudier leurs gènes d’intérêt dans les lignées cellulaires de leur choix, y compris les cellules souches, avec une expression stable des protéines.

Ce nouveau protocole basé sur la technologie ZFN (Zinc Finger Nuclease Technology) vient compléter la gamme de services à façon CompoZr et va permettre la construction de cellules isogéniques avec une expression stable et permanente.

Les avantages de cette technologie par rapport aux méthodes existantes sont nombreuses : la technologie traditionnelle d’insertion au hasard pour introduire une construction d'ADN dans le génome humain peut causer des perturbations au niveau du gène concerné et des variabilités épigénétiques au niveau de l'expression ce qui rend les comparaisons entre les cellules difficiles. Le Kit CompoZr utilise une construction ZFN qui cible spécifiquement le locus AAVS1 dans le génome humain permettant ainsi des insertions mono ou bi-allelic avec un contrôle par le chercheur du nombre et du lieu d’intégration.

Principe du kit CompoZr Targeted Integration–AAVS1

A. le gène d'intérêt (GOI) est sous-cloné dans le plasmide pZDonor au niveau de la séquence d'insertion multi-sites (MCS). Cette région est entourée à droite et à gauche par les séquences homologues au site d'intégration génomique AAVS1.

B. Plasmide pZDonor modifié ayant intégré le gène d'intérêt : pZDonor-GOI.

C. Le plasmide modifié est co-transfecté dans la lignée cellulaire humaine choisie avec l'ARNm fourni codant pour les Zinc-Finger Nucléases (ZFNs) qui ciblent le site d'intégration AAVS1.

D. Les nucléases ZFNs se fixent sur le site AAVS1 de l'ADN nucléaire et produisent une coupure double-brin.

E. La cellule utilise alors le plasmide pZDONOR comme matrice de réparation. Le système de réparation homologue induit par les ZFNs conduit à l'intégration dirigée du gène d'intérêt au niveau du locus AAVS1. Le gène peut alors être transcrit soit par le promoteur endogène au niveau du site AAVS1 soit par un promoteur spécifique inséré en amont du gène d'intérêt.

  

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